PCR, an e freagairt slabhraidh polymerase, a tha a’ toirt iomradh air cur-ris dNTP, Mg2+, factaran leudachaidh agus factaran leudachaidh leudachaidh don t-siostam fo catalysis DNA polymerase, a’ cleachdadh an DNA pàrant mar theamplaid agus primers sònraichte mar thoiseach tòiseachaidh an leudachaidh , Tro na ceumannan dì-nàdurachaidh, annealing, leudachadh, msaa, faodaidh am pròiseas ath-riochdachadh in vitro dualan nighean DNA a bharrachd air teamplaid dualan pàrant DNA àrdachadh gu sgiobalta agus gu sònraichte air DNA targaid sam bith in vitro.
1. Hot Start PCR
Chan e an ùine tòiseachaidh airson leudachadh ann am PCR àbhaisteach an inneal PCR a chuir a-steach don inneal PCR, agus an uairsin tòisichidh am prògram ag àrdachadh.Nuair a bhios rèiteachadh an t-siostaim deiseil, tòisichidh an leudachadh, a dh ’fhaodadh leudachadh neo-shònraichte adhbhrachadh, agus faodaidh PCR tòiseachadh teth an duilgheadas seo fhuasgladh.
Dè a th’ ann am PCR tòiseachaidh teth?Às deidh an siostam ath-bhualadh ullachadh, thèid an inneal-atharrachaidh enzyme a leigeil ma sgaoil aig teòthachd àrd (mar as trice nas àirde na 90 ° C) aig ìre teasachaidh tùsail an ath-bhualadh no ìre “tòiseachaidh teth”, gus am bi an DNA polymerase air a ghnìomhachadh.Tha an dearbh ùine gnìomhachaidh agus teòthachd an urra ri nàdar an DNA polymerase agus an inneal-atharrachaidh tòiseachaidh teth.Bidh an dòigh seo gu ìre mhòr a’ cleachdadh mion-atharraichean leithid antibodies, ligands dàimh, no atharraichean ceimigeach gus casg a chuir air gnìomhachd DNA polymerase.Leis gu bheil gnìomhachd DNA polymerase air a bhacadh aig teòthachd an t-seòmair, tha teicneòlas tòiseachaidh teth a ’toirt seachad deagh ghoireas airson grunn shiostaman ath-bhualadh PCR ullachadh aig teòthachd an t-seòmair gun a bhith ag ìobairt sònraichteachd ath-bheachdan PCR.
2. RT-PCR
Tha RT-PCR (PCR tar-sgrìobhadh cùil) na dhòigh deuchainneach airson ath-sgrìobhadh air ais bho mRNA gu cDNA agus a chleachdadh mar theamplaid airson leudachadh.Is e an dòigh deuchainneach RNA iomlan a thoirt a-mach ann am figheagan no ceallan an toiseach, Oligo (dT) a chleachdadh mar primer, cleachd transcriptase air ais gus cDNA a cho-chur, agus an uairsin cDNA a chleachdadh mar theamplaid airson leudachadh PCR gus an gine targaid fhaighinn no abairt gine a lorg.
3. PCR cainneachdail fluorescent
PCR cainneachdail fluorescent (PCR cainneachdail fìor-ùine,RT-qPCR) a’ toirt iomradh air an dòigh air buidhnean flùraiseach a chur ris an t-siostam ath-bhualadh PCR, a’ cleachdadh cruinneachadh de chomharran flùraiseach gus sùil a chumail air a’ phròiseas PCR gu lèir ann an àm fìor, agus mu dheireadh a’ cleachdadh an lùb àbhaisteach gus an teamplaid a mhion-sgrùdadh gu cainneachdail.Tha dòighean qPCR air an cleachdadh gu cumanta a’ toirt a-steach SYBR Green I agus TaqMan.
4. PCR neadaichte
Tha PCR neadaichte a’ toirt iomradh air cleachdadh dà sheata de primers PCR airson dà chuairt de leudachadh PCR, agus is e toradh leudachaidh an dàrna cuairt am criomag gine targaid.
Ma dh’ adhbhraicheas mì-chothromachadh den chiad phaidhir de primers (primers a-muigh) gun tèid toradh neo-shònraichte a mheudachadh, tha an comas gun tèid an aon roinn neo-shònraichte aithneachadh leis an dàrna paidhir de primers agus leantainn air adhart ag àrdachadh glè bheag, mar sin tha an leudachadh leis an dàrna paidhir de primers, chaidh sònrachas PCR a leasachadh.Is e aon bhuannachd a bhith a’ coileanadh dà chuairt de PCR gu bheil e a’ cuideachadh le bhith ag àrdachadh toradh gu leòr bho DNA tòiseachaidh cuibhrichte.
5. Touchdown PCR
Tha Touchdown PCR na dhòigh air sònrachas ath-bhualadh PCR a leasachadh le bhith ag atharrachadh paramadairean cearcall PCR.
Ann an touchdown PCR, tha an teòthachd annealing airson a’ chiad beagan chearcaill air a shuidheachadh beagan ìrean os cionn an teòthachd annealing as àirde (Tm) de na primers.Faodaidh teòthachd annealing nas àirde lùghdachadh gu h-èifeachdach air leudachadh neo-shònraichte, ach aig an aon àm, bidh teòthachd analachaidh nas àirde ag àrdachadh dealachadh primers agus sreathan targaid, a’ leantainn gu toradh PCR nas ìsle.Mar sin, anns a’ chiad beagan chearcaill, mar as trice bidh an teòthachd annealing sìos 1 ° C gach cearcall gus susbaint a’ ghine targaid san t-siostam àrdachadh.Nuair a thèid an teòthachd analing sìos chun teòthachd as fheàrr, thathas a’ cumail suas an teòthachd annealing airson na cuairtean a tha air fhàgail.
6. Direct PCR
Tha PCR dìreach a’ toirt iomradh air leudachadh DNA targaid gu dìreach bhon sampall gun fheum air aonaranachd searbhag niuclasach agus glanadh.
Tha dà sheòrsa de PCR dìreach ann:
modh dìreach: gabh beagan de shampall agus cuir gu dìreach e gu PCR Master Mix airson comharrachadh PCR;
modh sgàineadh: às deidh an sampall a shìoladh, cuir ris an lysate, lyse gus an genome a leigeil ma sgaoil, gabh beagan de lysed supernatant agus cuir ri PCR Master Mix e, dèan aithne PCR.Bidh an dòigh-obrach seo a’ sìmpleachadh sruth-obrach deuchainneach, a’ lughdachadh ùine làimhseachail, agus a’ seachnadh call DNA aig ceumannan glanaidh.
7. SOE PCR
Bidh splicing gine le leudachadh thar-tharraing PCR (SOE PCR) a’ cleachdadh primers le cinn co-phàirteach gus toraidhean PCR a dhèanamh a’ cruthachadh slabhraidhean a tha a’ dol thairis air, gus am bi anns an ath-bhualadh leudachaidh às deidh sin, tro leudachadh nan slabhraidhean tar-tharraingeach, diofar thùsan de dhòigh-obrach A anns a bheil pìosan meudaichte air an ceangal thairis air. agus spliced ri chèile.Tha dà phrìomh stiùireadh tagraidh aig an teicneòlas seo an-dràsta: togail ghinean fusion;mùthadh gine air a stiùireadh le làrach.
8. IPCR
Bidh Inverse PCR (IPCR) a’ cleachdadh primers co-phàirteach cùil gus mìrean DNA a mheudachadh a bharrachd air an dà phrìomhaire, agus ag àrdachadh sreathan neo-aithnichte air gach taobh de chriomag DNA aithnichte.
Chaidh IPCR a dhealbhadh an toiseach gus an t-sreath de roinnean neo-aithnichte faisg air làimh a dhearbhadh, agus tha e air a chleachdadh sa mhòr-chuid airson sgrùdadh a dhèanamh air sreathan brosnachaidh gine;ath-rèiteachaidhean cromosomal oncogenic, leithid fusion gine, tar-shuidheachadh agus tar-chur;agus amalachadh gine viral, cuideachd air an cleachdadh gu cumanta a-nis Airson mutagenesis air a stiùireadh le làrach, dèan lethbhreac de plasmid leis a’ mhilleadh a tha thu ag iarraidh.
9. dPCR
Tha PCR didseatach (dPCR) na dhòigh air tomhas iomlan de mholacilean searbhag niuclasach.
An-dràsta tha trì dòighean ann airson tomhas de mholacilean searbhag niuclasach.Tha photometry stèidhichte air sùghadh moileciuilean searbhag niuclasach;Tha PCR cainneachdail fìor-ùine (Fìor-ùine PCR) stèidhichte air luach Ct, agus tha luach Ct a’ toirt iomradh air an àireamh cearcall a tha co-chosmhail ris an luach flùraiseach a lorgar;Is e PCR didseatach an teicneòlas cainneachdail as ùire a tha stèidhichte air dòigh PCR aon-moileciuil airson a bhith a’ cunntadh searbhag niuclasach mar dhòigh cainneachdail iomlan.
Ùine puist: Jun-13-2023